Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy Oleanolic Acid của tế bào đinh lăng (Polyscias Fruticosa (L.) Harms) nuôi cấy In Vitro

Nội dung text: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy Oleanolic Acid của tế bào đinh lăng (Polyscias Fruticosa (L.) Harms) nuôi cấy In Vitro

1. gen trong sản xuất các hợp chất thứ cấp. Vì vậy, phần lớn các hóa chất như JA, MeJA, SA, ET được sử dụng để nghiên cứu kích kháng in vitro. Trong đó, MeJA là chất kích kháng được sử dụng phổ biến nhất (chiếm khoảng 60% các công trình đã công bố) cho thấy sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy cơ quan và tế bào thực vật, theo sau là SA (15%) và JA (10%) [47]. 4.3.2. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sinh trưởng tế bào Thông thường, bổ sung các elicitor vào môi trường nuôi cấy đều ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào, kết quả này được công bố trên nhiều công trình nghiên cứu trước đây. Chẳng hạn, các elicitor như MeJA, Ag+, chitosan và dịch chiết từ nấm (polysaccharide) ở các nồng độ khác nhau đều ức chế sinh trưởng của tế bào Taxus chinensis [126]. Kết quả nghiên cứu của Frankfater và cs (2009) về ảnh hưởng của MeJA và SA lên sự tạo thành gossypol, 6-methoxygossypol và 6,6’-dimethoxygossypol trong nuôi cấy rễ tơ cây G. barbadense cũng cho thấy MeJA có tác dụng ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào [40]. Trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật, bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy sẽ dẫn đến việc ngừng sinh trưởng tạm thời hay vĩnh viễn của tế bào, điều này cũng có thể dẫn đến các phản ứng phòng vệ bằng cách chuyển từ trạng thái chuyển hóa sơ cấp (sinh trưởng) sang sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp [62]. Ngoài ra, khi xử lý elicitor ở nồng độ cao hơn nồng độ tối ưu thường dẫn đến hiện tượng đáp ứng quá mức, gây chết tế bào [22]. Trong đề tài này, cả YE và MeJA đều có sự tác động lên sinh trưởng của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ, trong đó YE có tác động mạnh hơn MeJA (Bảng 3.9 và 3.11). Đối với YE, bổ sung các nồng độ khác nhau (1-3 g/L) vào môi trường tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy đều làm giảm mạnh sự sinh trưởng của tế bào, sinh khối tươi của tế bào chỉ còn 1/4-1/3 so với đối chứng. Tuy nhiên, thời gian xử lý elicitor càng ngắn mức độ ảnh hưởng càng giảm, bổ 84
2. mg/L ở các thời điểm khác nhau đều làm tăng biểu hiện của các các gen trong chu trình phenylpropanoid và sự tích lũy của rosmarinic acid. Mức độ biểu hiện của các gen RAS và HPPR tăng lên cao nhất là 1,84, 1,97 và 2,86 lần khi được xử lý YE ở các mốc thời gian 3, 6 và 12 giờ. Đối với gen PAL, mức độ phiên mã tăng lên tới 52,31 lần khi xử lý bằng AgNO3 sau 24 giờ [91]. Ngoài ra, một số nghiên cứu trước đây cũng cho thấy sự tăng biểu hiện của các gen khi được xử lý elicitor, ví dụ gen OsWRKY53 trong tế bào cây lúa khi xử lý cerebroside từ nấm [33], hay gen tham gia vào con đường tổng hợp phytosterol và triterpene trong tế bào cây rau má (C. asiatica) sau khi được xử lý bằng SA [68]. Kết quả trình bày ở bảng 3.10 và 3.12 cho thấy, sử dụng YE làm elicitor cho hiệu quả tốt hơn so với MeJA trong việc kích thích tăng khả năng tích lũy oleanolic trong tế bào cây đinh lăng lá nhỏ. Bổ sung YE vào môi trường tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy đã ảnh hưởng đến sự tích lũy oleanolic acid của tế bào. Ở môi trường bổ sung YE nồng độ 1 g/L, sinh tổng hợp oleanolic acid đã tăng 6,47 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor. Ở công thức bổ sung YE nồng độ 3 g/L, hàm lượng oleanolic acid cũng cao gấp 2,5 lần so với đối chứng (Bảng 3.10). Như vậy, nồng độ YE khi bổ sung vào môi trường đã ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tích lũy oleanolic acid. Đối với MeJA, hàm lượng oleanolic acid đạt cao nhất gấp 5,19 lần so với đối chứng khi bổ sung 100 µM vào ngày thứ 3 của quá trình nuôi cấy (Bảng 3.12). Theo một số nghiên cứu đã công bố, 100 µM MeJA được sử dụng khá phổ biến để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào, tương tự như kết quả thu được của luận án, trong đó có sản xuất oleanolic acid. Wiktorowska và cs (2010) đã tăng cường khả năng sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Calendula officinalis. Tác giả nhận thấy hàm lượng oleanolic thu được phụ thuộc vào nồng độ elicitor và thời điểm xử lý. Sau 72 giờ xử lý với 100 µM MeJA, hàm lượng oleanolic acid thu được từ tế 86
3. vietnamensis), tác giả nhận thấy sự tích lũy saponin cao nhất khi được xử lý với 150 mg/L YE, cao hơn so với các loại elicitor khác như MeJA và SA [63]. Khi nghiên cứu sản xuất L-Dopa từ nuôi cấy tế bào cây Mucuna pruriens, Raghavendra và cs (2011) nhận thấy 0,2 g/L YE có hiệu quả tốt nhất (62,35 mg/g), tiếp đến là 200 μM MeJA (45,93 mg/g), chitin và pectin có tác dụng ít hơn [98]. Việc sử dụng đồng thời cả MeJA và YE để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật đã được thực hiện nhiều, trong phần lớn trường hợp, MeJA cho hiệu quả tốt hơn YE. Rau má chứa nhiều loại triterpenoid như madecassoside, asiaticoside, madecassic acid và asiatic acid, Baek và cs (2020) đã nuôi cấy rễ tơ cây rau má để tăng cường khả năng sản xuất các loại triterpenoid này. Khi bổ sung MeJA và salicylic acid vào môi trường nuôi cấy, các tác giả nhận thấy không có sự khác biệt lớn về sinh trưởng của rễ tơ ở các nồng độ xử lý khác nhau. Hàm lượng triterpenoid thu được cao nhất (60,25 mg/g khối lượng khô) khi tác giả bổ sung 400 μM MeJA vào môi trường nuôi cấy [28]. Trong chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật, các gen đóng vai trò quan trọng là β-amyrin synthase (BAS) và CYP716A (Hình 1.4) [95]. Hai gen oxidosqualene cyclase đáp ứng với MeJA (MeJA-responsive oxidosqualene cyclases) là ObAS1 và ObAS2 ở cây Ocimum basilicum đã được Misra và cs (2014) nghiên cứu. Hai gen này mã hóa các chuỗi polypeptide dài 761 và 765 amino acid. Chức năng của 2 enzyme này được xác định là tham gia xúc tác tổng hợp β-amyrin và α-amyrin, là tiền chất trực tiếp để sản xuất các triterpene dạng oleanane và ursane. ObAS1 được xác định là β-amyrin synthase trong khi ObAS2 là enzyme amyrin synthase xúc tác tổng hợp đồng thời cả -amyrin và α- amyrin [77]. Do đó, Cơ chế tác động của MeJA trên cây đinh lăng lá nhỏ có thể cũng tương tự như ở cây Ocimum basilicum, đó là kích hoạt các gen xúc tác tổng hợp β-amyrin, là tiền chất để tổng hợp oleanolic acid. 88
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong giới hạn nghiên cứu và các kết quả đạt được của đề tài, một số kết luận được rút ra như sau: 1. Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L KIN, 30 g/L sucrose và 9 g/L agar là tốt nhất cho khả năng sinh trưởng của callus thân cây đinh lăng lá nhỏ. Khối lượng tươi và khô trung bình của callus đạt lần lượt là 0,1239 g và 0,0088 g, tích lũy sinh khối khô tăng 23% so với đối chứng. 2. Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L BAP kết hợp với 0,5 mg/L 2,4-D, 20 g/L sucrose tốt nhất cho sự sinh trưởng của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ, sinh khối khô đạt 0,45 g/bình, cao hơn khoảng 50% so với mẫu đối chứng. 3. Sử dụng YE ở nồng độ 1 g/L bổ sung sau 6 ngày nuôi cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao nhất, gấp 6,47 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (164,34 mg so với đối chứng 25,40 mg/g khối lượng khô). Sử dụng MeJA ở nồng độ 100 µM bổ sung sau 3 ngày nuôi cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao gấp gần 5,2 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (131,83 mg/g khối lượng khô). KIẾN NGHỊ Đề tài cần được tiếp tục nghiên cứu theo hướng ứng dụng, mở rộng ở quy mô pilot, từ đó hoàn thiện quy trình sản xuất oleanolic acid để có thể áp dụng vào sản xuất ở quy mô công nghiệp. 90
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Hồng Anh, Nguyễn Thị Phụng, Trần Chí Hải (2018), Khảo sát điều kiện bảo quản cao chiết ethanol từ lá đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harm, Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 Trường đại học công nghiệp thực phẩm tp Hồ Chí Minh, tr. 130-137. 2. Huỳnh Thị Mai Duyên, Dương Thị Hồng Thắm, Trần Chí Hải (2018), Nghiên cứu quá trình trích ly saponin triterpenoid từ lá đinh lăng với sự hỗ trợ của dung môi, Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 Trường đại học công nghiệp thực phẩm tp Hồ Chí Minh, tr. 81-88. 3. Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2015), Nuôi cấy mô lá đinh lăng (Polyscias fruticosa L.Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt chất saponin tích lũy, Tạp chí Khoa học Trường đại học An Giang, 7(1), tr. 75-83. 4. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, quyển III, NXB Trẻ, TP. Hồ Chí Minh. 5. Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Hải (2013), Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms), Tạp chí Dược học, 53(10). 6. Đào Duy Hưng, Lê Thị Hảo, Nguyễn Thị Hương Xiêm, Ngô Xuân Bình, Nguyễn Sinh Huỳnh (2017), Nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms), Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 8, tr. 46-52. 7. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn (Catharanthus roseus), TC Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9(6), tr. 5- 66. 92
6. Bình (2017), Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phát sinh hình thái in vitro Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms), Hội nghị khoa học khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, tr. 1866-1872. 18. Nguyễn Thị Thơ, Khuất Thị Hải Ninh, Vũ Thị Phan, Lê Viết Việt, Bùi Văn Thắng (2018), Nhân giống in vitro đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harms), Tạp chí khoa học và công nghệ lâm nghiệp, 4, tr. 15-21. 19. Tô Thị Nhã Trầm, Trương Phi Yến, Tôn Trang Ánh, Hoàng Thanh Tùng, Hà Thị Mỹ Ngân, Dương Tấn Nhựt (2020), Phát sinh phôi soma cây đinh lăng lá xẻ nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms) thông qua nuôi cấy mẫu lá ex vitro, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 18(3), tr. 497-506. 20. Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú, Trần Thị Ngọc Hà, Hoàng Văn Dương, Lê Tấn Đức, Lương Thị Yến, Phan Tường Lộc (2020), Ảnh hưởng của colchicine đến khả năng tạo tứ bội ở rễ tơ đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms), Báo cáo toàn văn Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2020, tr. 941-946. 21. Đỗ Tiến Vinh, Mai Thị Phương Hoa, Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Hoàng Trang Nhã, Trần Văn Minh (2015), Sản xuất saponin bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo đinh lăng (Polyscisa fruticosa L. Harms), Tạp chí Sinh học, 37(1se), tr. 135-141. TIẾNG ANH 22. Al-Khayri J.M., Naik P.M. (2020), Elicitor-induced production of biomass and pharmaceutical phenolic compounds in cell suspension culture of date palm (Phoenix dactylifera L.), Molecules, 25(20), pp. 4669. 23. Alsoufi A.S.M., Pączkowski C., Długosz M., Szakiel A. (2019), Influence of selected abiotic factors on triterpenoid biosynthesis and saponin secretion in marigold (Calendula officinalis L.) in vitro hairy root cultures, Molecules, 24(16), pp. 2907. 94
7. 32. Cheong J.J., Choi Y.D. (2003), Methyl jasmonate as a vital substance in plants., TRENDS in Genetic, 19(7), pp. 409-413. 33. Chujo T., Takai R., Akimoto-Tomiyama C., Ando S., Minami E., Nagamura Y., Kaku H., Shibuya N., Yasuda M., Nakashita H., Umemura K., Okada A., Okada K., Nojiri H., Yamane H. (2007), Involvement of the elicitor-induced gene OsWRKY53 in the expression of defense-related genes in rice, Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression, 1769(7), pp. 497-505. 34. Chung I.M., Rekha K., Rajakumar G., Thiruvengadam M. (2017), Jasmonic and salicylic acids enhanced phytochemical production and biological activities in cell suspension cultures of spine gourd (Momordica dioica Roxb), Acta Biol Hung, 68(1), pp. 88-100. 35. Długosz M., Wiktorowska E., Wiśniewska A., Pączkowski C. (2013), Production of oleanolic acid glycosides by hairy root established cultures of Calendula officinalis L., Acta Biochimica Polonica, 60(3), pp. 467-473. 36. Długosz M., Markowski M., Pączkowski C. (2018), Source of nitrogen as a factor limiting saponin production by hairy root and suspension cultures of Calendula officinalis L., Acta Physiologiae Plantarum, 40(2), pp. 35. 37. Ellard-Ivey M., Douglas C.J. (1996), Role of jasmonates in the elicitor- and wound-Inducible expression of defense genes in parsley and transgenic tobacco, Plant Physiology, 112(1), pp. 183-192. 38. Ferrari S. (2010), Biological elicitors of plant secondary metabolites: mode of action and use in the production of nutraceutics, Adv Exp Med Biol, 698, pp. 152-166. 39. Fontanay S., Grare M., Mayer J., Finance C., Duval R.E. (2008), Ursolic, oleanolic and betulinic acids: Antibacterial spectra and selectivity indexes, Journal of Ethnopharmacology, 120(2), pp. 272-276. 96
8. 48. Horiuchi K., Shiota S., Hatano T., Yoshida T., Kuroda T., Tsuchiya T. (2007), Antimicrobial activity of oleanolic acid from Salvia officinalis and related compounds on vancomycin-resistant enterococci (VRE), Biol Pharm Bull, 30(6), pp. 1147-1149. 49. Huan V.D., Yamamura S., Ohtani K., Kasai R., Yamasaki K., Nham N.T., Chau H.M. (1998), Oleanane saponins from Polyscias fruticosa, Phytochemistry, 47(3), pp. 451-457. 50. Huang P., Xia L., Zhou L., Liu W., Wang P., Qing Z., Zeng J. (2021), Influence of different elicitors on BIA production in Macleaya cordata, Scientific Reports, 11(1), pp. 1-7. 51. Huang W.Y., Cai Y.Z., Zhang Y. (2010), Natural phenolic compounds from medicinal herbs and dietary plants: potential use for cancer prevention, Nutr Cancer, 62(1), pp. 1-20. 52. Ilczuk A., Jagiełło-Kubiec K., Jacygrad E. (2013), The effect of carbon source in culture medium on micropropagation of common ninebark (Physocarpus opulifolius (L.) Maxim.) 'Diable D'or', Acta Scientiarum Polonorum - Hortorum Cultus, 12(3), pp. 23-33. 53. Isah T. (2019), Stress and defense responses in plant secondary metabolites production, Biological Research, 52, pp. 1-25. 54. Janicsák G., Veres K., Zoltán Kakasy A., Máthé I. (2006), Study of the oleanolic and ursolic acid contents of some species of the Lamiaceae, Biochemical Systematics and Ecology, 34(5), pp. 392-396. 55. Kim Y.B., Reedb D.W., Covellob P.S. (2015), Production of triterpenoid sapogenins in hairy root cultures of Silene vulgaris, Natural Product Communications, 10(11), pp. 1919-1922. 56. Kochkin D.V., Sukhanova E.S., Nosov A.M. (2014), Their accumulation of triterpene glycosides in the growing cycle cell suspension cultures 98
9. 64. Liu J. (1995), Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid, Journal of Ethnopharmacology, 49(2), pp. 57-68. 65. Loc N.H., Anh N.H.T., Binh D.H.N., Yang M.S., Kim T.G. (2010), Production of glycoalkaloids from callus cultures of Solanum hainanense Hance, Journal of Plant Biotechnology, 37, pp. 96-101. 66. Loc N.H., Thanh L.T.H. (2011), Solasodine production from cell culture of Solanum hainanense Hance, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(3), pp. 581-586. 67. Loc N.H., Anh N.H.T., Khuyen L.T.M., An T.N.T. (2014), Effects of yeast extract and methyl jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis in cell cultures of Solanum hainanense Hance, J Plant Biochem Biotechnol, 3(1), pp. 1-6. 68. Loc N.H., Giang N.T., Huy N.D. (2016), Effect of salicylic acid on expression level of genes related with isoprenoid pathway in centella (Centella asiatica (L.) Urban) cells, 3 Biotech, 6(1), pp. 86-93. 69. Luczkiewcz M., Cisowski W. (2001), Optimisation of the second phase of a two phase growth system for anthocyanin accumulation in callus cultures of Rudbeckia hirta, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65(1), pp. 57-68. 70. Luyen N.T., Dang N.H., Binh P.T.X., Hai N.T., Dat N.T. (2018), Hypoglycemic property of triterpenoid saponin PFS isolated from Polyscias fruticosa leaves, Annals of the Brazilian Academy of Sciences, 90(3), pp. 2881-2886. 71. Ma X.H., Zhao Y.C., Yin L., Han D.W., Ji C.X. (1982), Studies on the effect of oleanolic acid on experimental liver injury, Yao Xue Xue Bao, 17(2), pp. 93-97. 72. Manivannan A., Soundararajan P., Park Y.G., Jeong B.R. (2016), Chemical elicitor-induced modulation of antioxidant metabolism and enhancement of secondary metabolite accumulation in cell suspension 100
10. 79. Moscatiello R., Baldan B., Navazio L. (2013), Plant Cell Suspension Cultures. In Maathuis FJM, ed. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols. Totowa, NJ, Humana Press: 77-93 80. Murashige T., Skoog F. (1962), A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15(3), pp. 473-497. 81. Naik P.M., Al-Khayri J.M. (2016), Abiotic and Biotic Elicitors–Role in Secondary Metabolites Production through In vitro Culture of Medicinal Plants. In Shanker AK, Shanker C, eds. Abiotic and Biotic Stress in Plants - Recent Advances and Future Perspectives, IntechOpen: 82. Namdeo A.G. (2007), Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: A review, Pharmacognosy Reviews, 1(1), pp. 69-79. 83. Ncube B., Van Staden J. (2015), Tilting Plant Metabolism for Improved Metabolite Biosynthesis and Enhanced Human Benefit, Molecules, 20(7), pp. 12698-12731. 84. Neumann K.H., Kumar A., Imani J. (2009), Plant cell and tissue culture-A Tool in biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. 85. Nhan N.H., Loc N.H. (2017), Production of eurycomanone from cell suspension culture of Eurycoma longifolia, Pharmaceutical Biology, 55(1), pp. 2234-2239. 86. Nhan N.H., Loc N.H. (2018), Enhancement of eurycomanone biosynthesis in cell culture of longjack (Eurycoma longifolia) by elicitor treatment, Journal of Plant Biotechnology, 45(4), pp. 340-346. 87. Niikawa M., Hayashi H., Sato T., Nagase H., Kito H. (1993), Isolation of substances from glossy privet (Ligustrum lucidum Ait.) inhibiting the mutagenicity of benzo[a]pyrene in bacteria, Mutat Res, 319(1), pp. 1-9. 88. Nopo-Olazabal C., Condori J., Nopo-Olazabal L., Medina-Bolivar F. (2014), Differential induction of antioxidant stilbenoids in hairy roots of Vitis 102
11. 97. Radman R., Saez T., Bucke C., Keshavarz T. (2003), Elicitation of plants and microbial cell systems, Biotechnol Appl Biochem, 37(Pt 1), pp. 91-102. 98. Raghavendra S., Ramesh C.K., Kumar V., Moinuddin Khan M.H. (2011), Elicitors and precursor induced effect on L-Dopa production in suspension cultures of Mucuna pruriens L, Frontiers in Life Science, 5(3-4), pp. 127-133. 99. Rahimi S., Devi B.S.R., Khorolragchaa A., Kim Y.J., Kim J.H., Jung S.K., Yang D.C. (2014), Effect of salicylic acid and yeast extract on the accumulation of jasmonic acid and sesquiterpenoids in Panax ginseng adventitious roots, Russian Journal of Plant Physiology, 61(6), pp. 811-817. 100. Rhee H.S., Cho H.-Y., Son S.Y., Yoon H.S.-Y., J.M. J.M.P. (2010), Enhanced accumulation of decursin and decursinol angelate in root cultures and intact roots of Angelica gigas Nakai following elicitation, Plant Cell Tissue Organ Culture, 101, pp. 295-302. 101. Sakr S.S., Melad S.S., El-Shamy M.A., Elhafez A.E.A. (2014), In vitro propagation of Polyscias fruticosa plant, International Journal of Plant & Soil Science, 3(10), pp. 1254-1265. 102. Salehi M., Moieni A., Safaie N., Farhadi S. (2019), Elicitors derived from endophytic fungi Chaetomium globosum and Paraconiothyrium brasiliense enhance paclitaxel production in Corylus avellana cell suspension culture, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 136(1), pp. 161-171. 103. Sharma M., Sharma A., Ashwani K., Kumar B.S. (2011), Enhancement of secandary metabolites in cultured plant cells thoungh stress stimulus, American Journal of Plant Physiology, 6(2), pp. 50-71. 104. Sheper T. (2001), Advances in biochemical engineering biotechnology- plant cell, Springer-Verlag, Berlin Heideberg. 105. Singh G.B., Singh S., Bani S., Gupta B.D., Banerjee S.K. (1992), Anti- inflammatory activity of oleanolic acid in rats and mice, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 44(5), pp. 456-458. 104
12. 113. Thanh N.T., Murthy H.N., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2005), Methyl jasmonate elicitation enhanced synthesis of ginsenoside by cell suspension culture of Panax ginseng in 5L balloon type bubble bioreactor, Apply Microbiology Biotechnology, 67, pp. 197-201. 114. Titova M.V., Popova E.V., Shumilo N.A., Kulichenko I.E., Chernyak N.D., Ivanov I.M., Klushin A.G., Nosov A.M. (2021), Stability of cryopreserved Polyscias filicifolia suspension cell culture during cultivation in laboratory and industrial bioreactors, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 145(3), pp. 591-600. 115. Tung N.T., Thi P.T.D., Sang D.N., Thao D.T., Quang H.T. (2022), Biomass accumulation of Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino in cell suspension cultures inhibiting human cancer cell growth, Research Journal of Biotechnology, 17, pp. 61-68. 116. VanEtten H.D., Mansfield J.W., Bailey J.A., Farmer E.E. (1994), Two Classes of Plant Antibiotics: Phytoalexins versus "Phytoanticipins", Plant Cell, 6(9), pp. 1191-1192. 117. Veerashree V., Anuradha C.M., Vadlapudi K. (2012), Elicitor-enhanced production of gymnemic acid in cell suspension cultures of Gymnema sylvestre R. Br., Plant Cell Tiss Organ Cult, 108, pp. 27-35. 118. Vijaya S.N., Udayasri P.V.V., Aswani K.Y., Ravi B.B., Phani K.Y., Vijay V.M. (2010), Advancements in the production of secondary metabolites, Natural Products, 3, pp. 112-123. 119. Warhade M., Badere R. (2018), Fusarium oxysporum cell elicitor enhances betalain content in the cell suspension culture of Celosia cristata, Physiol Mol Biol Plants, 24(2), pp. 285-293. 120. Wiktorowska E., Długosz M., Janiszowska W. (2010), Significant enhancement of oleanolic acid accumulation by biotic elicitors in cell 106
13. PHỤ LỤC 1. Đường chuẩn oleanolic acid Hình 1. Đường chuẩn oleanolic acid Trong đó: y: Diện tích đỉnh (peak) (mAU*s) x: Nồng độ oleanolic acid trong mẫu (µg/mL) 2. Kiểm tra độ tinh sạch của oleanolic acid chuẩn 108