Luận án Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

Nội dung text: Luận án Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

1. 198. Muis, Biomass production and formulation of Bacillus subtilis for biological control. Indonesian Journal of Agricultural Science, 2006, 7(2),51-56 199. Nashwa, Shaimaa, Mohamed, Ahmed, Formualations of Bacillus spp. and Pseudomonas fluorescens for biocontrol of cantaloupe root rot caused by Fusarium solani. Journal of plant protection research, 2013, 53 (3), 295-300. 154
2. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. THÔNG TIN THU THẬP, PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU *Thông tin vườn lấy mẫu tại tỉnh Đắk Lắk 1. Huyện Buôn Hồ Tên chủ hộ Thẩm Thị Mơ Địa chỉ Xã Bình Thuận, thị xã Buôn Hồ, tỉnh Đăk Lăk Giống tiêu Vĩnh Linh Trụ trồng Trụ bê tông Loại đất Đất đỏ bazan Tuổi vườn 5 năm tiêu Diện tích 3 sào Đặc điểm sinh Cây hồ tiêu sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh. trưởng 2. Huyện Eakar Vườn 1 2 3 Tên chủ Trần Văn Vũ Trần Văn Thùy Trần Văn Vũ vườn Địa chỉ Thôn Linh Thanh 1, Thôn Linh Thanh 1, Thôn Linh Thanh 1, xã Eakmut xã Eakmut xã Eakmut Giống tiêu Vĩnh linh Vĩnh linh Vĩnh linh Trụ trồng Muồng đen Bê tông + cây keo Bê tông+ cây keo, gòn Loại đất Đất xám Đất xám Đất xám Tuổi vườn 5 năm 5 năm 3 năm tiêu Diện tích 1 sào 2 sào 1 sào Đặc điểm Cây hồ tiêu sinh Cây hồ tiêu sinh Cây hồ tiêu sinh sinh trưởng trưởng và phát triển trưởng và phát triển trưởng và phát triển khỏe mạnh. khỏe mạnh khỏe mạnh. 3. Huyện Krông Năng Vườn 1 2 Tên chủ vườn Ngô Kim Ngọc Qúy Nguyễn Văn Thanh Địa chỉ TDP7, thị trấn Krông Năng, TDP8, thị trấn Krông Năng. Giống tiêu Vĩnh linh Vĩnh linh Trụ trồng Trụ bê tông, trồng xen bơ Trụ bê tông, trồng xen bơ Loại đất Đất dỏ bazan Đất đỏ bazan Tuổi vườn 6 năm 5 năm tiêu Diện tích 200 trụ 400 trụ Đặc điểm sinh Cây hồ tiêu sinh trưởng và Cây hồ tiêu sinh trưởng và phát trưởng phát triển khỏe mạnh. triển khỏe mạnh P1
3. Loại đất Đất đỏ Bazan Đất đỏ Bazan Đất đỏ Bazan. Đất đỏ Bazan. Diện tích 5.000 trụ 1.500 trụ 1.200 trụ 8.000 trụ Cây hồ tiêu sinh Cây hồ tiêu Cây hồ tiêu Cây hồ tiêu sinh Đặc điểm trưởng và phát sinh trưởng và sinh trưởng và trưởng và phát sinh trưởng triển khỏe phát triển khỏe phát triển khỏe triển khỏe mạnh. mạnh. mạnh. mạnh. 2. Huyện Chư Suê Vườn 1 2 3 Tên chủ Nguyễn Văn Phạm Văn Thanh Phạm Ngọc Hơn vườn Toản Địa chỉ Thị trấn Chư Suê Xã Ayun Xã Ayun Giống tiêu Vĩnh linh Vĩnh linh Vĩnh linh Trồng trụ bê tông cùng với trụ sống là cây keo, Trụ trồng Trồng trụ bê tông Trồng trụ bê tông núc nác, trồng xen cà phê Tuổi vườn 5 năm tuổi 3 năm 5 năm tiêu Loại đất Đỏ bazan Đỏ bazan Đỏ bazan Diện tích 1ha 0.5 ha 0.8 ha Cây hồ tiêu sinh trưởng Cây hồ tiêu sinh Cây hồ tiêu sinh Đặc điểm và phát triển khỏe trưởng và phát trưởng và phát triển sinh trưởng mạnh. triển khỏe mạnh. khỏe mạnh. 3. Huyện Chư Pưh Vườn 1 2 3 Tên chủ Nguyễn Thị Ngọc Nguyễn Thị Ngọc Nguyễn Thị Thúy vườn Mai Mai Địa chỉ Xã Ia Blứ Xã Ia Blứ Xã Ia Blứ Giống tiêu Vĩnh linh Vĩnh linh Vĩnh linh Trụ gỗ và trụ keo Trụ gỗ và trụ keo Trụ trồng Trụ keo sống sống sống Tuổi vườn 5 năm 3 năm 3 năm tiêu Loại đất Đỏ bazan Đỏ bazan Đỏ bazan Diện tích 500 trụ 300 trụ 300 trụ Cây hồ tiêu sinh Đặc điểm Vườn tiêu bị bệnh Vườn tiêu bị bệnh trưởng và phát triển sinh trưởng khỏe mạnh. Thông tin vườn lấy mẫu tỉnh Đắk Nông 1. Huyện Đắk Rlấp Vườn 1 2 Tên chủ vườn Nguyễn Văn Thanh Hoàng Ngọc Nhơn Địa chỉ Thôn 2 xã Quảng Tín Thôn 3 xã Kiến Thành Giống tiêu Vĩnh linh Vĩnh linh 50% chết – 50% sống(cây keo, Trụ trồng Muồng đen, xen trụ chết muồng, goòng,) Tuổi vườn tiêu 5 năm 4 năm P3
4. * Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu Bảng 1. Hình thái các chủng vi khuẩn phân lập tại Đắk Lắk Khuẩn lạc Tế bào Cấu TT Chủng Hình Mặt cắt Hình Màu sắc Mép trúc Gram dạng ngang dạng hạt Trắng đục bên trong, Lượn Đồng 1 RB. BH1 Tròn Lõm Que + rìa không sóng nhất màu Lượn Đồng 2 RB. BH2 Tròn Trắng sữa Gồ ghề Que + sóng nhất Bằng Lồi Đồng 3 RB. BH3 Tròn Trắng đục Cầu + phẳng cong nhất Bằng Dạng Đồng 4 RB. BH4 Tròn Trắng sữa Que + phẳng giọt nhất Bằng Dạng Đồng 5 RB. BH5 Tròn Trắng sữa Que + phẳng giọt nhất Giữa trắng Răng Bằng Đồng 6 RB. BH6 Tròn sữa, rìa Cầu + cưa phẳng nhất trắng đục Màu trắng Bằng Lồi Đồng 7 RB. BH7 Tròn Que + sữa phẳng cong nhất Màu trắng Bằng Lồi Đồng 8 RB. BH8 Tròn Cầu + sữa phẳng cong nhất Bằng Dạng Đồng 9 RB. BH9 Tròn Màu vàng Que + phẳng giọt nhất Màu nâu Tròn mép nhạt, mép Răng Đồng 10 RB. BH10 Lõm Que + răng cưa không cưa nhất màu Dạng gấp Gồ Không Cuộn 11 RB. BH11 Màu trắng Que - nếp ghề đều song Không Bằng Dạng Đồng 12 RB. BH12 Tròn Que + màu phẳng nón nhất Tròn có Màu nâu Lượn Đồng 13 RB. BH13 vành ở Lõm Que + nhạt sóng nhất mép Hình Không Đồng 14 RB. BH14 Màu trắng Lõm Que + không đều đều nhất Hình Màu trắng Lượn Đồng 15 RB. BH15 Gồ ghề Que + không đều đục sóng nhất Trong Tròn, mép trắng sữa, Lượn Đồng 16 RB. EK1 Lõm Cầu + răng cưa rìa trắng sóng nhất đục P5
5. Bằng Dạng Đồng 37 RB. KN5 Tròn Trắng sữa Que + phẳng nón nhất Bằng Dạng Đồng Que 38 RB. KN6 Tròn Màu trắng + phẳng nón nhất Hình Răng Bằng Hạt 39 RB. KN7 Màu trắng Cầu - không đều cưa phẳng nhỏ Bằng Đồng 40 RB. KN8 Tròn Màu trắng Gồ ghề Que - phẳng nhất Màu vàng Bằng Bằng Đồng 41 RB. KN9 Tròn Que + cam phẳng phẳng nhất Màu trắng Răng Hạt 42 RB. KN10 Tròn Gồ ghề Que + sữa cưa lớn Dạng tròn Màu vàng Răng Cuộn 43 RB. KN11 mép răng Gồ ghề Cầu + tươi cưa sóng cưa Răng Bằng Hạt 44 RB. KN12 Tròn Màu trắng Que + cưa phẳng nhỏ Trắng hơi Bằng Lồi Đồng 45 RB. CK1 Tròn Phẩy + vàng phẳng cong nhất Bằng Lồi Đồng 46 RB. CK2 Tròn Trắng sữa Que - phẳng cong nhất Bằng Lồi Đồng 47 RB. CK3 Tròn Trắng sữa Que - phẳng cong nhất Bằng Lồi Đồng 48 RB. CK4 Tròn Trắng sữa Que - phẳng nhọn nhất Tròn Bằng Bằng Đồng 49 RB .CK5 Trắng Que + không đều phẳng phẳng nhất Bằng Bằng Đồng 50 RB. CK6 Tròn Trắng Cầu + phẳng phẳng nhất Bằng Lồi Đồng Que 51 RB.CK7 Tròn Trắng đục + phẳng nhọn nhất Bằng Lồi Đồng Que 52 RB.CK8 Tròn Vàng nhạt - phẳng cong nhất Bằng Lồi Que 53 RB. CK9 Tròn Vàng Nhỏ + phẳng cong Bằng Lồi Đồng 54 RB. CK10 Tròn Trắng Cầu - phẳng nhọn nhất Bằng Lồi Đồng Cầu 55 RB. CK11 Tròn Vàng nhạt - phẳng cong nhất Bằng Lồi Đồng Cầu 56 RB. CK12 Tròn Trắng + phẳng cong nhất Răng Lồi 57 RB .CK13 Tròn Trắng Lớn Que + cưa cong Không Lượn Bằng 58 RB .CK14 Trắng Lớn Cầu + đều sóng phẳng Răng Lồi 59 RB .CK15 Tròn Trắng Lớn Que - cưa cong P7
6. Răng Lồi 82 RB.CK38 Tròn Trắng Lớn Que - cưa cong Bằng Lồi Đồng 83 RB.CK39 Tròn Trắng Cầu + phẳng cong nhất Tròn Lượn 84 RB.CK40 Trắng Gồ ghề Lớn Que + không đều sóng Bằng Lồi Đồng 85 RB.CK41 Tròn Trắng Cầu + phẳng cong nhất Răng Lồi 86 RB.CK42 Tròn Trắng Lớn Que + cưa cong Giữa màu trắng đục, Lượn Lồi Đồng 87 RB.BM1 Tròn Que - mép màu sóng cong nhất trắng sữa Bằng Lồi Đồng 88 RB.BM2 Tròn Trắng đục Que - phẳng cong nhất Giữa trắng Tròn Bằng Hình Đồng 89 RB.BM3 đục mép Cầu - không đều phẳng nón nhất trăng sữa Dạng Răng 90 RB.BM4 Tròn Trắng Lõm hạt Que - cưa lớn Dạng Bằng 91 RB.BM5 Tròn Trắng Hơi lồi hạt Que - phẳng nhỏ Giữa màu Dạng Tròn trắng đục, Bằng Lồi 92 RB.BM6 hạt Que - không đều mép màu phẳng cong nhỏ trắng sữa Màu trắng Lượn Cuộn Cầu 93 RB.BM7 Phức tạp Lõm - sữa sóng sóng Giữa màu Cầu Đồng trắng đục, Bằng Lồi 94 RB.BM8 Tròn nhất + mép trắng phẳng cong trong Giữa màu Cầu Tròn da cam, Lượn Lồi Đồng 95 RB.BM9 + không đều ngoài màu sóng cong nhất trắng đục Răng Lồi Đồng 96 RB.BM10 Gấp nếp Trắng Que - cưa cong nhất Lượn Lồi Đồng 97 RB.BM11 Tròn Trắng Cầu - sóng cong nhất Giữa màu trắng đục, Răng Cuộn 98 RB.BM12 Bầu dục Ghồ ghề Que - mép màu cưa sóng trắng sữa P9
7. ngoài màu trắng đục Giữa màu Que Dạng trắng đục, Răng Lồi 114 RB.BM28 Tròn hạt - mép màu cưa cong lớn trắng sữa Giữa màu Que trắng đục, Răng Đồng 115 RB.BM29 Tròn Phẳng - mép màu cưa nhất trắng sữa Dạng Cầu Bằng Lồi 116 RB.BM30 Tròn Trắng hạt - phẳng cong lớn Răng Dạng Đồng Cầu 117 RB.BM31 Dạng rễ Trắng - cưa nón nhất Giữa màu Dạng Tròng trắng đục, Răng 118 RB.BM32 Hơi lồi hạt Que - không đều mép màu cưa lớn trắng sữa Giữa màu Dạng da cam, Bằng Bầu 119 RB.BM33 Đồng tâm Hơi lồi hạt - ngoài màu phẳng dục nhỏ trắng đục Lượn Lồi Đồng 120 RB.BM34 Tròn Trắng Que - sóng cong nhất Bảng 2 Hình thái các chủng vi khuẩn phân lập tại Gia Lai Khuẩn lạc Tế bào TT Chủng Hình Màu Mặt cắt Cấu Hình Mép Gram dạng sắc ngang trúc dạng Tròn, Gồ ghề Hạt lớn Que Lượn 1 RB.CS1 gấp Trắng + sóng nếp Bằng Lồi cong Đồng Cầu 2 RB.CS2 Tròn Trắng + phẳng nhất Bằng Dạng giọt Đồng Cầu 3 RB.CS3 Tròn Trắng - phẳng nhất Bằng Hình nón Đồng Cầu 4 RB.CS4 Tròn Trắng + phẳng nhất Trắng ở Cầu - mép, Răng Đồng 5 RB.CS5 Tròn Phẳng vàng ở cưa nhất trong Bằng Hình nón Đồng Cầu 6 RB.CS6 Tròn Trắng - phẳng nhất Bằng Đồng Cầu 7 RB.CS7 Tròn Trắng Phẳng - phẳng nhất P11
8. phẳng nhất Bằng Phẳng Hạt lớn Que 30 RB.CS30 Tròn Trắng + phẳng Bằng Lồi cong Đồng Cầu 31 RB.CS31 Tròn Trắng - phẳng nhất Bằng Hình nón Đồng Cầu 32 RB.CS32 Tròn Trắng - phẳng nhất Dạng Lượn Phẳng Đồng Que 33 RB.CS33 Trắng + amip sóng nhất Bằng Dạng giọt Đồng Cầu 34 RB.CS34 Tròn Trắng - phẳng nhất Bằng Lồi cong Đồng Que 35 RB.CS35 Tròn Trắng - phẳng nhất Bằng Lồi cong Đồng Que 36 RB.CS36 Tròn Trắng - phẳng nhất Gần Lượn Phẳng Đồng Que 37 RB.CS37 Trắng + tròn sóng nhất Bằng Lồi cong Đồng Cầu 38 RB.CS38 Tròn Trắng - phẳng nhất Hình Cầu Bằng Đồng 39 RB.CS39 bầu Trắng Lồi nhọn + phẳng nhất dục Hơi Xanh Lượn Đồng Cầu 40 RB.CP1 Phẳng - tròn nhạt sóng nhất Tròn Vàng ở có tâm, Bằng Đồng 41 RB.CP2 vành trắng ở Lồi cong Que phẳng nhất + ở mép mép Bằng Lồi cong Đồng Chuỗi 42 RB.CP3 Tròn Vàng + phẳng nhất Bằng Dạng giọt Đồng Cầu 43 RB.CP4 Tròn Trắng + phẳng nhất Răng Lồi cong Đồng Cầu 44 RB.CP5 Tròn Trắng + cưa nhất Cầu Bằng Đồng 45 RB.CP6 Tròn Trắng Hình nón - phẳng nhất Cầu Bằng Đồng 46 RB.CP7 Tròn Trắng Lồi cong - phẳng nhất Lồi cong Đồng Cầu Bằng 47 RB.CP8 Tròn Vàng nhất + phẳng Bằng Đồng 48 RB.CP9 Tròn Vàng Dạng giọt Que - phẳng nhất P13
9. Bằng Đồng Cầu 69 RB.ĐC13 Tròn Trắng Lồi cong - phẳng nhất Bằng Đồng 70 RB.ĐC14 Tròn Vàng Dạng giọt Cầu + phẳng nhất Vàng ở Que tâm Bằng Đồng 71 RB.ĐC15 Tròn Dạng giọt + trắng ở phẳng nhất mép Gấp Ghồ Lượn Hạt lớn Que 72 RB.ĐC16 Trắng + nếp ghề sóng Bảng 3. Hình thái các chủng vi khuẩn phân lập tại Đắk Nông Khuẩn lạc Tế bào Chủng TT vi khuẩn Hình Mặt cắt Cấu Hình Màu sắc Mép Gram dạng ngang trúc dạng Tròn Trắng Lồi Cuộn 1 RB.ĐS1 không Có múi Que - đục cong sóng đều Trắng Lượn Lồi 2 RB.ĐS2 Tròn đều Hạt lớn Cầu + đục sóng cong Tròn Trắng, Răng Lồi Đồng 3 RB.ĐS3 không hồng Chuỗi - cưa cong nhất đều tâm Bằng Lồi,có Đồng 4 RB.ĐS4 Tròn đều Trắng Chuỗi - phẳng lỗ ở tâm nhất Trắng Rắng Cuộn 5 RB.ĐS5 Tròn Lõm Chuỗi - đục cưa sóng Trắng Bằng Lồi Đồng 6 RB.ĐS6 Tròn đều Tròn + sữa phẳng cong nhất Trắng 7 RB.ĐS7 Tròn Có múi Lõm Hạt nhỏ Tròn + đục Rắng Lồi Đồng Hình 8 RB.ĐS8 Tròn đều Trắng - cưa cong nhất que Trắng, Răng Bằng Đồng 9 RB.ĐS9 Tròn Chuỗi - tâm cam cưa phẳng nhất Răng Bằng Dạng 10 RB.ĐS10 Tròn Trắng Que - cưa phẳng hạt Trắng đục, tâm Răng Bằng Cuộn 11 RB.ĐS11 Tròn Chuỗi - trắng cưa phẳng sóng sữa Tròn Trắng Răng Bằng Dạng 12 RB.ĐS12 không Chuỗi - đục cưa phẳng hạt đều P15
10. Trắng Bằng Dạng 30 RB.ĐS30 Tròn Hạt nhỏ Cầu - đục phẳng giọt Trắng Lượn Lồi Cuộn 31 RB.ĐS31 Quả lê Cầu - đục sóng nhọn sóng Không Trắng Không Bằng Đồng 32 RB.ĐS32 Cầu + đều đục đều phẳng nhất Tròn Trắng Răng 33 RB.ĐS33 không Phẳng Hạt nhỏ Que + đục cưa đều Vàng Dạng Bằng Đồng 34 RB.CJ1 Tròn Que trong giọt phẳng nhất + Vàng Lồi Bằng Đồng 35 RB.CJ2 Tròn Cầu đậm cong phẳng nhất - Trắng Lồi Bằng Đồng 36 RB.CJ3 Gần tròn Cầu trong cong phẳng nhất - Trắng Lồi Bằng Đồng 37 RB.CJ4 Tròn Que trong cong phẳng nhất + Trắng Bằng Lượn Đồng 38 RB.CJ5 Gần tròn Que + trong phẳng sóng nhất Nhăn Dạng nheo, có Trắng Răng 39 RB.CJ6 Lõm đồng Que - vành ở đục cưa nhất mép Trắng Lồi Bằng Đồng 40 RB.CJ7 Tròn Cầu - trong cong phẳng nhất Nhăn nheo, có 41 Trắng Lượn Dạng Que RB.CJ8 vành ở lõm - đục sóng hạt lớn mép Tròn, có Lượn Đồng 42 RB.CJ9 vành ở Vàng Lõm Que - sóng nhất mép Tròn, có Trắng Răng Đồng 43 RB.CJ10 vành ở Lõm Que + đục cưa nhất mép Trắng Bằng Lượn Đồng 44 RB.CJ11 Tròn Que + trong phẳng sóng nhất Tròn, có Trắng Lượn Đồng - 45 RB.CJ12 vành ở Lõm Que đục sóng nhất mép Dạng Hồng Bằng 46 RB.CJ13 Phẳng Hạt nhỏ Que - đồng tâm nhạt phẳng Tròn, có Dạng Bằng 47 RB.CJ14 vành ở Trắng Hạt nhỏ Que + giọt phẳng mép trong Vàng Bằng Răng Đồng 48 RB.CJ15 Đồng tâm Que nhạt phẳng cưa nhất + P17
11. Trắng Bằng Bằng Đồng 70 RB.CJ37 Tròn Que + trong phẳng phẳng nhất Trắng Bằng Lượn Đồng 71 RB.CJ38 Tròn Que trong phẳng sóng nhất - Tròn, có Vàng Lồi Bằng Đồng 72 RB.CJ39 vành ở Que đậm cong phẳng nhất - mép Trắng Lồi Bằng Đồng 73 RB.CJ40 Tròn Que - đục cong phẳng nhất Răng Bằng Đồng 74 Tròn Trắng Que + RB.CJ41 cưa phẳng nhất Đồng Vàng Lồi Lượn Dạng 75 RB.CJ42 Que + nhất trong cong sóng hạt nhỏ Hình Vàng Bằng Răng Đồng 76 RB.CJ43 không Cầu - đậm phẳng cưa nhất đều Trắng Bằng Lượn Đồng 77 RB.CJ44 Gần tròn Cầu - trong phẳng sóng nhất Hình ảnh bộ chủng giống vi khuẩn phân lập tại Gia Lai P19
12. GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGA CGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACA AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACC TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCG CGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCT GCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA CGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTT Chủng RB.CJ41 Accession LC602155 Sequence (3’ – 5’) TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCC GGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAA CATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATT AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGA CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGA CGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTG TTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCA GGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGG TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGA AGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGG AGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG CTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATA GGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT GATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTG ACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG ACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAA CCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAG TCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACA CCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGT Chủng RB.EK7 Accession LC602156 Sequence (3’ – 5’) ATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCC GGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGA CATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATT AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGA P21
13. PHỤ LỤC 3. KÉT QUẢ PHÂN TÍCH HỢP CHẤT KHÁNG PHYTOPHTHORA, FUSARIUM VÀ TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS VÀ LC - MS GC-MS của Bacillus velezensis RB.DS29 P23
14. 2. Xác định thành phần hóa học trong dịch nuôi cấy của chủngvi khuẩn vùng rễ tuyển chọn có khả năng kháng nấm Fusarium bằng phân tích LC-MS và GC-MS KẾT QUẢ PHÂN TÍCH GC-MS GC-MS của chủng Bacillus subtilis CJ41 P25
15. Xác định một số nhóm hợp chất có hoạt tính kháng tuyến trùng Meiloidogyne sp. của các chủng vi khuẩn vùng rễ Bacillus velezensis EK7 bằng phân tích LC-MS VÀ GC- MS Kết quả phân tích GC-MS P27
16. hiện hình dưới đèn UV (λ = 254 nm) (Hình 3.15). Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) được trình bày trong bảng 2 và phụ lục 5.4, 5.5. Khối phổ HR-ESI-MS (phụ lục 5.6) cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z = 125.0354, so với lý thuyết có m/z 125.0356, sai số 0.2 mmass, phù hợp với công thức phân tử là C5H6O2N2 (M = 126.0450). Hợp chất có độ bất bão hòa bằng 4. Phổ 1H-NMR cho thấy hợp chất VK04 xuất hiện 1 tín hiệu đơn của 1 proton cộng hưởng tại 7.21 ppm (1H, s) và 1 tín hiệu của nhóm methyl cộng hưởng tại 1.69 ppm (3H, s). Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất VK04 có 5 tín hiệu carbon trong đó 2 tín hiệu carbon olefin tại 108.0 ppm và 138.3 ppm, 2 tín hiệu >C=O tại 151.9, 165.4 ppm 13 và 1 tín hiệu carbon methyl tại 12.0 ppm.Khi so sánh phổ C-NMR (DMSO-d6) cho thấy hợp chất VK04 có cấu trúc tương tự VK01 và sự khác nhau là VK04 có 1 carbon methyl cộng hưởng tại 12.0 ppm. Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR được trình bày trong bảng 3.41, đề nghị cấu trúc của hợp chất VK04 là thymine. Bảng 2. Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất VK04 và thymine VK04 (DMSO-d ) Thymine (DMSO-d ) No 6 6 H (ppm), J (Hz) C (ppm) H (ppm), J (Hz) C (ppm) 2 151.9 153.9 4 165.4 168.3 5 108.0 110.9 6 7.21 (1H, s) 138.3 7.28 139.8 5-CH3 1.69 (3H, s) 12.0 1.75 12.1 ( ) *Hợp chất VK05 VK05 là chất rắn màu trắng vô định hình, tan tốt trong DMSO. Sắc ký lớp mỏng cho 1 vết duy nhất có Rf = 0.55 với hệ dung môi giải ly chloroform:methanol = 9:1, 1 hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 (10%) trong EtOH. Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz), phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz), phổ HSQC (DMSO-d6) và phổ HMBC (DMSO-d6) trình bày trong bảng 3 và phụ lục 5.8, 5.9, 5.10, 5.11. Khối phổ HR-ESI- MS (phụ lục 5.7) cho mũi ion phân tử giả [M+H]+ tại m/z = 155.0815, so với lý thuyết có m/z 155.0815, sai số 0.0 mmass, phù hợp với công thức phân tử là C7H10O2N2 (M P29
17. Hexahydropyrrolo [1,2- o N VK05 (DMSO-d6) a]pyrazine-1,4-dione (D2O) H (ppm), J (Hz) C (ppm) HMBC H (ppm), J (Hz) (500 MHz) (125 MHz) (푯 → 푪) (400 MHz) 1 - 169.7 3.52 (1H, dd, 16.5, 4.6) 3.77 (1H, d, 17.3) 2 46.1 3.98 (1H, dd, 16.6, 1.8) C1, C4 4.04 (1H, d, 2.7) 3 8.04 (1H, s) - C2, C5 4 - 164.3 5 4.11 (1H, t, 7.41) 58.3 C1, C4, C6, C8 4.22 (1H, s) 1.82 (1H, m) 1.96 (1H, s) 6 28.1 2.13 (1H, m) C5, C7, C8 2.23 (1H, s) 7 1.82 (2H, m) 22.2 C5, C6, C8 1.84 (2H, d, 5.6) 8 3.36 (2H, m) 44.9 C1, C5, C6, C7 3.44 (2H, dd, 8.7, 4.8) ( ) Li và cs (2014) [187] P31
18. 5.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất VK01 5 6 4 2 P33
19. 5.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất VK04 H2O 5-CH3 DMSO 6 P35
20. 5.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VK04 P37
21. 5.10. Phổ HSQC của hợp chất VK05 P39
22. PHỤ LỤC 5. HÌNH ẢNH Hình 1. Hoạt tính kháng nấm Phyopthora của một số chủng vi khuẩn vùng rễ P41
23. A B Hình 4. A: Hình cây biểu hiện bệnh do Phytophthora B: Hình cây bị bệnh hoàn toàn Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 P43
24. Hình 8. Ảnh hưởng của pH đến mật độ của chủng RB.CJ41 Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ của chủng RB.CJ41 Hình 10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ chủng RB.CJ41 P45
25. 24h 36h Hình 12. Ảnh hưởng của thời gian đến mật độ chủng RB.EK7 Hình 13. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến hoạt tính kháng Phytophthora P47
26. Hình 15. Hoạt tính kháng Phytophthora của các hợp chất VK01, VK04 và VK05 sau 3 ngày ở nồng độ 20mg/ml Hình 16. Hoạt tính kháng nấm Fusarium của các hợp chất VK01, VK04 và VK05 sau 7 ngày ở nồng độ 20mg/ml Hình 17. Sợi Phytophthora bị gãy gập, xoắn ở phần tiếp giáp với đĩa giấy chứa hợp chất tinh khiết P49
27. Hình 21. Trứng tuyến trùng bị tác động bởi hợp chất tinh khiết Hình 22. Hệ thống lên men vi khuẩn DS29 lúc 8g Hình 23. Mật độ vi khuẩn Bacillus velezensis ĐS29 trong chế phẩm với các chất mang khác nhau ở thời điểm bảo quản 90 ngày P51
28. Hình 25. Mật độ vi khuẩn trong chế phẩm vi khuẩn vùng rễ RB.CJ41 Hình 26. Hoạt tính kháng nấm của chế phẩm chứa vi khuẩn RB.CJ41 P53