Luận án Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/CAS9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine Max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/CAS9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine Max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt

1. 82 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN So sánh với các công trình trước đây trong cùng lĩnh vực và hướng nghiên cứu, chúng tôi thấy được những phát hiện mới, những đóng góp khoa học từ kết quả nghiên cứu trong luận án này. Các thông tin này được chúng tôi thảo luận kỹ trong các phần dưới đây: 4.1 Hiệu quả chuyển gen và chỉnh sửa gen của hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương Việt Nam Việc chuyển gen bền vững và ổn định vào cây đậu tương thường sử dụng nguyên liệu là lá mầm và đỉnh sinh trưởng. Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp này không cao, đòi hỏi có một quy trình tối ưu và cần nhiều thời gian, chi phí để hoàn thiện một quy trình và tạo được cây đậu tương chuyển gen. Do đó, hệ thống rễ tơ được xem là phương pháp hiệu quả trong các nghiên cứu về quá trình cộng sinh, khả năng hấp thu dinh dưỡng, tương tác với tác nhân gây bệnh và đặc biệt trong nghiên cứu chức năng gen hay chỉnh sửa gen trên đậu tương. Kết quả xây dựng hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và chuyển gen vào rễ tơ trên một số giống đậu tương nghiên cứu được trình bày ở mục 3.2.1. So với nghiên cứu của Chen và đồng tác giả năm 2018, lá mầm đậu tương 5 ngày tuổi bao gồm cuống lá dài 0,5 cm được sử dụng làm nguyên liệu biến nạp [81]. Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ của các giống đậu tương trong nghiên cứu này đạt 90-99%. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen chỉ đạt từ 30-60%. Tương tự như vậy, khi mầm 5 ngày tuổi được sử dụng trong biến nạp gen gfp trong công bố của Keyes và đồng tác giả năm 2009, tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ chỉ đạt 45%, trong đó số rễ tơ mang và biểu hiện gen chuyển chỉ đạt khoảng 55% [94]. Phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro với vật liệu là lá mầm 3 ngày tuổi của các giống đậu tương Việt Nam, chúng tôi đã thu được tỉ lệ chuyển gen cao nhất là 79,8% với giống ĐT26 khi sử dụng cấu trúc mang gen gfp. Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ cũng đạt trên 90% với giống đậu tương này. Phương pháp này đã cho kết quả biểu hiện gen trong thời gian ngắn hơn giúp giảm thiểu thời gian và chi phí cho việc kiểm tra hoạt động của các cấu trúc chuyển gen. Hệ thống CRISPR/Cas9 đã được áp dụng thành công để tạo đột biến gen thông
2. 84 GmGOLS03 và 63,3% đối với gen GmGOLS19 ở ba dòng chuyển gen thế hệ T0 (Hình 3.14). Trong khi đó, với đoạn trình tự mục tiêu chứa ít hơn 5 nucleotide thì chỉnh sửa gen giảm mức rất thấp, chỉ đạt 3,3% ở gen GmGOLS03 và 10% ở gen GmGOLS19; kết quả này phù hợp các báo cáo trước đó [97-98]. Kết quả nghiên cứu của luận án một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc lựa trình tự cắt cách mục tiêu (target) đối với các vị trí cắt đồng thời trong việc chỉnh sửa gen bằng hệ thống CRISPR/Cas9. 4.3 Khả năng xuất hiện đột biến định hướng muộn thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 Thông thường, khi cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 được chuyển vào tế vào thực vật, họat động của hệ thống này sẽ gây tạo đột biến định hướng. Các đột biến này có thể được phát hiện và xác định ở các dòng cây tái sinh. Tuy nhiên, việc tồn tại và hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen trong tế bào cây chủ có thể gây tạo các đột biến ở giai đoạn tiếp theo, thậm chí là ở các thế hệ tiếp theo của các dòng cây mang cấu trúc chỉnh sửa gen. Điều này được chúng tôi phát hiện và phân tích trong nghiên cứu này, kết quả được thể hiện trong mục 3.4. Đối với dòng đột biến DT1.1, tất cả các alen tìm thấy ở thế hệ T1 đều được quan sát thấy ở thế hệ T0 (Hình 3.14 và 3.16). Ngoài ra, những đột biến này được di truyền ổn định sang thế hệ T2. Tuy nhiên, đối với giống Marverick các cây T1 có nguồn gốc từ cây dòng chuyển gen thế hệ T0 dòng M3.1 và dòng M4.1 lại mang một số alen đột biến không được tìm thấy ở thế hệ T0 (Hình 3.14 và 3.16). Chứng tỏ, trên cây đậu tương việc chỉnh sửa gen tạo bằng CRISPR/Cas9 tạo được đột biến ở thế hệ T0, nhưng không phải lúc nào các đột biến của thế hệ T0 cũng di truyền sang thế hệ T1, kết quả nghiên cứu của luận án giống với kết quả nghiên cứu của Kanazashi và Kurtin đã công bố [58] [99]. Các mâu thuẫn trong kết quả của luận án có thể do sự hoạt động CRISPR xảy ra một cách độc lập muộn trong giai đoạn phát triển của cây T0, tạo ra đột biến khảm ở một số mô dùng phân tích và những mô khác cũng có nhưng chưa được xác định. Và các đột biến trong các mô chưa xác định có thể được di truyền ở các cây T1. Hiện tượng này trước đây đã được Kanazashi và cộng sự chứng minh, trong đó phân tích DNA của từng mẫu riêng lẻ được thực hiện và các alen quan sát được của chúng phù hợp với các hạt mang đột biến [58]. Phương pháp này có thể ứng dụng để nghiên cứu chỉnh sửa bộ gen trên đậu tương và một số loài
3. 86 enzyme đầu tiên tham gia vào quá trình sinh tổng hợp raffinose trong và có vai trò quan trọng trong con đường chuyển hóa RFOs [31] [105] bị gây đột biến bởi hệ thống CRISPR/Cas9. Kết quả nghiên cứu được chúng tôi trình bày ở mục 3.5.3 cho thấy: hạt của các dòng đậu tương mang đột biến GmGOLS có tổng hàm lượng RFOs giảm so với hạt của cây đối chứng không mang đột biến. Thành phần của RFOs (như: raffinose, sucrose, stachyose, verbascose ) có sự thay đổi. Cụ thể là hàm lượng raffinose tăng lên đến 65% trong khi stachyose và verbascose đều giảm tới 45%. Trong hạt đậu tương, stachyose là thành phần chính của RFOs, thế nên ở các dòng mang đột biến gen GmGOLS có tổng lượng RFOs trong hạt giảm 30,2% ở thể đột biến đơn và 35,2% ở thể đột biến kép. Ngoài ra, đối với những dòng mang đột biến kép (gen GmGOLS03 và gen GmGOLS19) có hàm sucrose giảm một cách đáng kể, nhưng đối với đột biến đơn gen GmGOLS03 lại không cho kết quả tương ứng. Dòng đậu tương PI 200508 được biết đến như dòng đậu tương điển hình có hàm lượng stachyose và raffinose thấp [104]. Sử dụng dòng này, Dierking và Bilyeu đã chứng minh raffinose synthase 2 (RS2) là gen có mang alen PI200508 [14], việc loại bỏ RS2 đã làm giảm hàm lượng stachyose ba lần và giảm 5 lần lượng raffinose cũng như tăng 50% hàm lượng sucrose trong hạt của cây trồng trong nhà kính [15]. Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy việc đột biến gen GmGOLS gây ảnh hưởng lớn đến sự tích tụ đường sucrose, raffinose và stachyose. Đáng ghi nhận nhất là sự gia tăng hàm lượng của đường raffinose, và sự giảm đồng thời hàm lượng stachyose, điều cho thấy mối liên hệ giữa chức năng của GmGOLS và rafinose tuy chưa rõ ràng nhưng điều này đã được các nhà khoa học lưu tâm trước đó. Các nghiên cứu trong tương lai hứa hẹn sự giải thích rõ hơn về mối tương quan của hàm lượng các carbohydrate được tạo ra theo phương thức chuyển gen với một số chất trung gian như myo-inositol và galactinol và có thể kết hợp kiểu gen gây bệnh được biết đến. Khi chúng tôi so sánh về RFOs có nguồn gốc từ các dòng mang đột biến đơn gen GmGOLS03 và đột biến kép (GmGOLS03, GmGOLS19) đã nhận thấy một số khác biệt kiểu hình có thể được cho là do GmGOLS19 mất chức năng. Tuy nhiên không có sự khác biệt về hàm lượng RFOs của hai dạng đột biến trên. Tổng hợp các dữ liệu nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng gen GmGOLS03 có thể có những ảnh hưởng quan trọng hơn đối với sự tổng hợp RFOs. Ở các dòng đột biến hàm lượng RFOs vẫn được tạo ra một lượng đáng kể trong hạt, điều này có thể giả định do hoạt
4. 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 được lựa chọn để gây tạo đột biến làm giảm hoạt động của enzyme galactinol synthase trên cây đậu tương dựa vào việc phân tích trình tự và mức độ biểu hiện gen. Cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mang hai trình tự định hướng gRNA đã được thiết kế thành công để gây tạo đột biến trên hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19. Cấu trúc này được gắn vào vector chuyển gen với hệ chọn lọc sử dụng thuốc trừ cỏ. 2. Hệ thống cảm ứng rễ tơ in vitro đã được thiết lập trên hai giống đậu tương ĐT22 và ĐT26 của Việt Nam với hiệu suất cao (71%- 79,8%). Các hệ thống cảm ứng rễ tơ này đã được áp dụng thành công trong đánh giá hiệu quả chuyển gen và biểu hiện của các gen chỉ thị gus và gfp. Tỉ lệ chuyển gen ghi nhận ở mức 72,33% đối với gen gus và 79,8% với gen gfp. Hệ thống này đã được ứng dụng để kiểm tra hoạt động của cấu trúc CRISPR/Cas9 trong việc gây tạo đột biến trên hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 trên các dòng rễ tơ của giống đậu tương nghiên cứu. Tỉ lệ gây tạo đột biến trên các dòng rễ tơ ghi nhận ở mức trên 80%. 3. Cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã hoạt động hiệu trong việc tạo các đột biến trên cả 2 gen GmGOLS03 và GmGOLS19 của hai giống đậu tương Maverick và ĐT26 . Các đột biến này nằm chính xác trong vùng định hướng gây tạo đột biến cho thấy sự hoạt động chính xác của hệ thống vector chỉnh sửa gen. 4. Các dòng đậu tương mang đột biến định hướng ở dạng đồng hợp tử của đơn gen hoặc cả hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 đã được xác định sự di truyền qua các thế hệ bằng kỹ thuật PCR. 5. Hạt của các dòng đậu tương mang đột biến đồng hợp tử một hoặc cả hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 có hàm lượng đường khó tiêu họ raffinose giảm đáng kể (giảm từ 30,2% đến 34,1%), hàm lượng đường succrose tăng lên (tăng từ 48% đến 51%) so với cây đậu tương giống gốc không mang đột biến. Ở một số dòng đậu tương đột biến (DT1.1-7-2, DT1.1-14-3) ghi nhận sự tăng lên đáng kể hàm lượng protein trong hạt. Tuy nhiên, không ghi nhận sự khác biệt về hình thái, khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng cây đậu tương đột biến so với cây giống gốc. 6. Các đột biến đồng hợp tử đơn gen hoặc cả hai gen GmGOLS, có hàm lượng
5. 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung và Phạm Thị Đào, Cây đậu tương, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 1999, 24 - 23. 2. FAO, 2019. [Online]. Available: xuat,-tieu-thu-dau-nanh-tren-the-gioi-11444.html. 3. Tổng cục thống kê Việt Nam, Niên Giám Thống Kê Tóm Tắt – 2020 (Statistical summary book), Hà Nội, 2020, 300. lieu-thong-ke/2021/07/nien-giam-thong-ke-tom-tat-2020/. 4. Trần Văn Lài, Thu thập và đánh giá nguồn vật liệu di truyền đậu đỗ 1991 – 1995, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1995, 21, 5-6. 5. Trần Duy Quý, Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 1999, 17 – 18. 6. Y. Hwang, Y. Nakamoto et al., Genetic diversity of cultivated and wild soybeans including Japanese elite cultivars as revealed by length polymorphism of SSR markers, Breeding Science, 2008, 58, 3, 315 –323. 7. Nguyễn Lộc Hiền, Trần Thanh Xuyên và cộng sự, Sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương rau Nhật Bản, Tạp chí Khoa học 2010. Đại học Cần Thơ, 2017, 16, 51-59. 8. K. B. Hari, et al., Engineering soybean for enhanced sulfur amino acid content, Crop Science, 2005, 45, 454 – 461. 9. A. M. Cabrejas, F.M. Disaz, et al., Influence of germination on the soluble carbohydrates and dietary fibre fractions in non-conventional legumes, Food Chemical, 2008, 107, 1045-1052. 10. N.C. Coon, L.K. Leske, et al., Effect of oligosaccharide-free soybean meal on true metabolizable energy and fiber digestion in adult roosters, Poultry Science, 2009, 6, 787–793. 11. A. Hou, P. Chen, et al., Sugar Variation in Soybean Seed Assessed with a Rapid Extraction and Quantification Method, Int J Agron, 2009, 1-8.
6. 92 phytic acid phenotype on soybean seeds, Plant Physiology, 2002, 128 , 650– 660. 22. G. Marie, J. Sidsel et al., Nitrogen split dose fertilization, plant age and frost effects on phytochemical content and sensory properties of curly kale (Brassica oleracea L. var. sabellica), Food Chemistry, 2016, 197, 530-538. 23. J. Buitink, A. M. Hemminga et al., Is there a role for oligosaccharides in seed longevity? An assessment of intracellular glass stability, Plant Physiology, 2000, 122, 1217–1224. 24. H. Uta, S. Klaus, Distribution and immunolocalization of stachyose synthase in Cucumis melo L., Planta, 1991, 185, 479–486. 25. M.P. Dey, Oligosaccharides in Dey PM, Harborne JB, Quemener B, Brillouer JM. Ciceritol, a pinitol disaccharide eds. Methods in plant biochemistry, 1990, Phytochemistry Academic Press, 189–218. 26. W. Bridgette, W. Kevin, Prebiotic inulin-type fructans and galacto- oligosaccharides: definition, specificity, function, and application in gastrointestinal disorders, Gastroenterology Hepatology, 2017, 32, 1, 64-68. 27. R. L. Obendorf, Oligosaccharides and galactosyl cyclitols in seed desiccation tolerance, Seed Science Research, 1997, 17, 2, 63 - 74. 28. H. Marcin, O. L. Ralph, Seed desiccation tolerance and storability: Dependence on flatulence-producing oligosaccharides and cyclitols—review and survey, Seed Science Research,1994, 4, 4, 385 - 405. 29. T. Peterbauer, J. Mucha et al., Chain‐elongation of raffinose in pea seeds. Isolation, characterization, and molecular cloning of a multifunctional enzyme catalyzing the synthesis of stachyose and verbascose, Chemical Biology, 2002, 277, 194–200. 30. P. Thomas, L. B. Leslaw et al., Analysis of the raffinose family oligosaccharide pathway in pea seeds with contrasting carbohydrate composition, Plant Physiology, 2001, 127, 1764 – 1772. 31. S. Sengupta, S. Mukherjee et al., Significance of galactinol and raffinose family oligosaccharide synthesis in plants, Frontier Plant Science, 2015, 6, 11.
7. 94 42. P. Mali, L. Yang et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science, 2013, 339, 823–826. 43. L. Cong, A. F. Ran et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems, Science, 2013, 339, 819–823. 44. E. Pennisi, The CRISPR craze, Science, 2013, 341, 833–836. 45. W. Shaohui, Z. Shuaibin et al., Efficient targeted mutagenesis in potato by the CRISPR/Cas9 system, Plant Cell Report, 2015, 34, 1473-1476. 46. E. Hirotaka, M. Naoko et al., The CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus, Scientific reports, 2013, 3, 2510. 47. W. Xue, C. Sidi et al., CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver, Nature, 2014, 514(7522), 380-384. 48. A. F. Ran, H. D. Patrick et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, Nature protocols, 2013, 8, 2281-2308. 49. K. Chylinski, S. K. Makarova et al. Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Research, 2014, 42, 6091-6105. 50. P. D. Weeks, H. M. Spalding et al., Use of designer nucleases for targeted gene and genome editing in plants., Plant Biotechnology, 2015, 14, 483-495. 51. G. Chunling, B. Paola et al., Mechanism of nonhomologous end-joining in mycobacteria: a low-fidelity repair system driven by Ku, ligase D and ligase C., Nature Structural and Molecular Biology, 2005, 12, 304–312. 52. H. Nishimasu, A.F. Ran et al., Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA, Cell, 2014, 156, 935–949. 53. H.S. Sternberg, S. Redding et al., DNA interrogation by the CRISPR RNA- guided endonuclease Cas9., Nature, 2014, 507, 62–67. 54. C. Le, M. A. Luciano et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems, Science, 2013, 339, 121, 819–823. 55. A. F. Ran, H. D. Patrick et al., Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity, Cell, 2013, 154, 1380–1389.
8. 96 67. K. Yoko, A. Fumitaka et al., A rapid method for detection of mutations induced by CRISPR/Cas9-based genome editing in common wheat, Plant Biotechnology (Tokyo), 2020, 37, 2, 247–251. 68. F.S. Andrew, L. Lena et al., Transient Expression of CRISPR/Cas9 Machinery Targeting TcNPR3 Enhances Defense Response in Theobroma cacao, Frontier Plant Science, 2018, 2, 9, 269-269. 69. G. Junping, W Genhong et al., CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum, Plant Molecular Biology, 2015, 87, 1-2, 99-110. 70. M. Mickael, V. Roberto et al., DNA-Free Genetically Edited Grapevine and Apple Protoplast Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, Frontier Plant Science, 2016, 7, 1904. 71. L. Choun-Sea, H. T. Chen et al., Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: from single-cell mutation detection to mutant plant regeneration, Plant Biotechnology, 2018, 16, 7, 1295-1310. 72. S. Hongmei, L. Ziliang et al., The application of CRISPR/Cas9 in hairy roots to explore the functions of AhNFR1 and AhNFR5 genes during peanut nodulation, BMC Plant Biology, 2020, 20, 417. 73. B. Guillaume, G. David et al., Efficient Genome Editing Using CRISPR/Cas9 Technology in Chicory, Molecular Science, 2019, 20, 5, 1155. 74. B. M. Nathaniel, J. H. Shelley et al., First-generation genome editing in potato using hairy root transformation, Plant Biotechnology, 2020,18, 2201–2209. 75. N. Sevon, C. Oksman, et al., Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation: Root Cultures as a Source of Alkaloids, Planta Medica, 2002, 68, 859-868. 76. C. D. Mary, T.A. David et al., Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells, Nature, 1992, 295, 432–434. 77. I.I. Ozyigit, I. Dogan et al., Agrobacterium rhizogenes‐mediated transformation and its biotechnological applications in crops, Crop Improvement, 2013, 1- 48.
9. 98 88. T. Noriaki, T. Masahiro, S. Shigeru, The sweet potato RbcS gene (IbRbcS1) promoter confers high-level and green tissue-specific expression of the GUS reporter gene in transgenic Arabidopsis, Gene, 2015, 567, 2, 244-250. 89. Z. Xiaoxiao, X. Yajie et al., An efficient genotyping method for genome- modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system., Scientific Reports, 2014, 4, 1–8. 90. D. T. Ta, N. M. Dung et al., Production of drought tolerant transgenic soybean expressing coda gene under regulation of a water stress inducible promoter, Pakistan Journal of Botany, 2020, 52, 3, 793–799. 91. T. Joshi, R. M. Fitzpatrick et al., Soybean knowledge base (SoyKB): A web resource for integration of soybean translational genomics and molecular breeding, Nucleic Acids Research, 2014, 42, 1245–1252. 92. S. Jeremy, C. B. Steven et al., Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature, 2010, 463, 178–183. 93. M. Stemmer, T. Thumberger et al., CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR / Cas9 Target , Prediction Tool, 2015, 9, 1–11. 94. C. Keyes, S. Subramanian et al., Hairy root as a model system for undergraduate laboratory curriculum and research., Biology Science, 2009, 35, 6-11. 95. C. Brooks, V. Nekrasov et al., Efficient Gene Editing in Tomato in the First Generation Using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-Associated9 System., Plant Physiology 2014,166, 1292– 1297. 96. J. Zhou, J. Wang et al., Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting, FEBS, 2014, 7, 1717-1725. 97. K. Xie, B. Minkenberg et al., Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system, Proc Natl Acad Sci USA, 2105, 112, 11, 3570–3575.
10. 100 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 1. Huy Le, Nhung Hong Nguyen, Dong Thị Ta, Thao Nhu Thi Le, Thao Phuong Bui, Ngoc Thu Le, Cuong Xuan Nguyen, Hardy Rolletschek, Gary Stacey, Minviluz G Stacey, Ngoc Bich Pham, Phat Tien Do, Ha Hoang Chu. “CRISPR/Cas9-mediated knockout of galactinol synthase-encoding genes resulted in low raffinose family oligosaccharides in soybean seeds”. Frontiers in Plant Science, 2020 Dec 17. Doi:10.3389/fpls.2020.612942. 2. Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Hồng Nhung, Lê Quang Huy, Bùi Phương Thảo, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Đỗ Tiến Phát. “Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ in vitro trên một số giống đậu tương phục vụ nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen”. Tạp chí Công nghệ sinh học, 2021, 19 (3), trang 459-470. 3. Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Hồng Nhung, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Đỗ Tiến Phát. “Xây dựng các chỉ thị phân tử trong phân tích sự di truyền các đột biến tạo được bằng hệ thống CRISPR/Cas9”. Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2021, trang 776-781. Đại học Thái Nguyên. 4. Duy Dinh Trinh, Ngoc Thu Le , Thao Phuong Bui, Thao Nhu Thi Le , Cuong Xuan Nguyen , Ha Hoang Chu, Phat Tien Doa. “A sequential transformation method for validating soybean genome editing by CRISPR/Cas9 system”. Đã gửi đăng (4/2022) trên tạp chí Saudi Journal of Biological Sciences
11. 102 alen WT (alen không đột biến) và alen đột biến mất 22 bp (Δ- G03 R CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG 22 bp) trên vùng gen đích GmGOLS03 GOLS-seg F TGGAGTCACACCCCTCAGTA Cặp mồi đặc hiệu để nhận biết alen WT (alen không đột biến) và alen đột biến mất 22 bp (Δ- G19 R GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC 22 bp) trên vùng gen đích GmGOLS19 GOLS-seg F1 AGACATGGAGTCACACCCCG Cặp mồi đặc hiệu để nhận biết alen mang đột biến Δ-33 bp trên G03 R CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG vùng gen đích GmGOLS03 GOLS-seg F1 AGACATGGAGTCACACCCCG Cặp mồi đặc hiệu để nhận biết alen mang đột biến Δ-33 bp trên G19 R GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC vùng gen đích GmGOLS19 GOLS-seg F3 AGACATGGAGTCACACATGC Cặp mồi đặc hiệu để nhận biết alen mang đột biến Δ-30 bp trên G03 R CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG vùng gen đích GmGOLS03 GOLS-seg F3 AGACATGGAGTCACACATGC Cặp mồi đặc hiệu để nhận biết alen mang đột biến Δ-30 bp trên G19 R GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC vùng gen đích GmGOLS19
12. 104 Kết quả phết Thế hệ Dòng Cas9 35S:pFGC lá DT1.1-22 R + + DT1.1-23 R + + DT1.1-24 R + + DT1.1-25 R + + DT1.1-26 R + + DT1.1-27 R + + DT1.1-28 R + + DT1.1-29 R + + T1 M3.1-2 R + + M3.1-5 S - - M3.1-6 R + + M3.1-9 S - - M4.1-1 R + + M4.1-2 S - - M4.1-4 S - - M4.1-5 R + + DT1.1-4-3 R + + DT1.1-5-4 R + + DT1.1-7-1 S - - DT1.1-7-2 S - - T2 DT1.1-13-1 R + + DT1.1-13-3 S - - DT1.1-14-1 R + + DT1.1-14-3 R + + Ghi chú: “R” thể hiện sự kháng thuốc trừ cỏ; “S” thể hiện sự không kháng thuốc trừ cỏ; “+” thể hiện sự có mặt của gen chuyển trong cây thông qua PCR; “-” thể hiện sự không có mặt của gen chuyển trong cây thông qua PCR