Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gama Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam

Cây chè xanh nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau: Phân giới
thực vật - Tracheobionta; Liên ngành hạt - Spermatophyta; Ngành -
Magnoliophyta; Lớp song tử diệp - Dicotyledonae - Magnoliopsida; Bộ chè
Theales - Dilleniide; Họ chè - Theaceae; Chi chè - Camellia L (Thea); Loài -
Camellia sinensis (L.) Kuntze (Tea, Wikipedia). Ngày nay, cây chè được trồng
ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải dài từ 30 vĩ
độ nam đến 45 vĩ độ bắc, tập trung chủ yếu ở các nước Châu Á chiếm 80 - 90%
tổng diện tích chè thế giới. Trong đó nổi tiếng là Ấn Độ, Trung Quốc, Kenya,
Sri Lanka, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam (Theo: Tea, Wikipedia).
Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh mà
cây chè Camellia Sinensis (L.) Kuntze được chia thành thành 4 loại (Liu, 2005):
- Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var.Macrophylla):
- Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var.Bohea)
- Chè Shan (Camellia sinensis var.Shan)
- Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica)
Tại Việt Nam, chè được trồng nhiều ở vùng Tây Bắc, vùng Việt Bắc -
Hoàng Liên Sơn, vùng Trung du - Bắc bộ, vùng Bắc Trung bộ và Tây Nguyên.
Năm 2019, Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng chè đứng thứ 5 và xuất
khẩu chè lớn thứ 3 trên thế giới với 123.400 ha diện tích trồng và hơn 500 cơ
sở sản xuất chế biến, công suất đạt trên 500.000 tấn chè khô mỗi năm, sản lượng
1025,2 ngàn tấn (Tổng cục Thống kê, 2019). 
pdf 178 trang phubao 24/12/2022 2201
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gama Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_cong_nghe_san_xuat_che_den_giau_gama_amin.pdf
  • pdfCông văn đăng thông tin bảo vệ luận án tiến sĩ.pdf
  • pdfCV đề nghị đăng toàn văn.pdf
  • pdfThông báo về việc Bảo vệ luận án tiến sĩ cấp Viện.pdf
  • pdfTom tat luấn án.pdf
  • pdfTrích yếu Luận án tiếng Việt và tiếng Anh.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gama Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam

  1. [27] Cappelletti S., Piacentino D., Daria P., Sani G., Aromatario M. (2015). Caffeine: cognitive and physical performance enhancer or psychoactive drug?. Current Neuropharmacology, 13(1), 7188. [28] Chen H., H. Xuanhui, J.L. Yan Liu, H. Qingyong, Z. Cuiying, W. Benjun, Z. Ye, W. Jie (2016). Extraction, purification and anti-fatigue activity of γ-aminobutyric acid from mulberry (Morus alba L.) leaves. Sci. Rep., 6 (18933), 1-10. [29] Cheng T.C., Tsai J.F. (2009). GABA tea helps sleep. Journal of Alternative and Complementary Medicine, 15(7), 697-701. [30] Cherng S.H., Huang C.Y., Kuo W.W., Lai S.E, Tseng C.Y., Lin Y.M., Tsai F.J, Wang H.F. (2014). GABA tea prevents cardiac fibrosis by attenuating TNF - alpha and Fas/FasL - mediated apoptosis in streptozotocin - induced diabetic rats, Food and Chemical Toxicology, 65, 90-96. [31] Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C. (2007). Production of gammaaminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells. J. Microbiol. Biotechnol. 17, 104-109. [32] Chung-Ang University Industry-University Cooperation Foundation, Rice Tech, South Korea. Assignee. Novel Strain of Lactic Acid Bacteria Capable of Producing Gamma-Amino Buyric Acid and Preparing Method for Gamma-Amino Butyric Acid Using the Same KR20120007917A. 2012. [33] Coda R., Melama L., Rizzello C.G., Curiel J.A., Sibakov J., Holopainen U., Sozer N. (2015). Effect of air classification and fermentation by Lactobacillus plantarum VTT E-133328 on faba bean (Vicia faba L.) flour nutritional properties. Int. J. Food Microbiol., 193, 34-42. [34] Cooper R., Morre D.J., Morre D.M. (2005a). Medicinal benefits of green tea Part I. Review of Non-Cancer Health Benefits. J Altern Complement Med., 11, 521-528. 131
  2. fermentation of sundried green tea. Journal of Tea Science. 25(3), 126-132. [49] Haas Doris, Pfeifer Bettina, Reiterich Christoph, Partenheimer Regina, Reck Bernhard, Buzina Walter, Samson R.A. (2013). Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea. International Journal of Food Microbiology, 166(2), 316-322. [50] Han S., S. Jeon, H. Lee, J. Lee (2017). Screening of γ -aminobutyric acid (GABA) -producing wild yeasts and their microbiological characteristics, Microbiology 45(3), 199-203. [51] Han S.M. & J.S. Lee (2017). Production and its anti-hyperglycemic effects of γ-aminobutyric acid from the wild yeast strain Pichia silvicola UL6-1 and Sporobolomyces carnicolor 402-JB-1. Mycobiology, 45(3), 199-203. [52] Hanshan Normal University (2011). Asgnee. Method for biologically synthesizing gamma-aminobutyric acid by pediococcus pentosaceus CN101654689A. 2011. [53] Harnentis H., N. Nurmiati, Y. Marlida, F. Adzitey, N. Huda (2019). γ - Aminobutyric acid production by selected lactic acid bacteria isolate of an Indonesian indigenous fermented buffalo milk (dadih) origin. Vet. World, 12, 2231-2916. [54] Hayakawa K., M. Kimura, K. Kasaha, K. Matsumoto, H. Sansawa (2004). Effect of a γ-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar - kyoto rats. Br. J. Nutr. 92, 411-417. [55] Hayat A., Jahangir T.M., Yar Khuhawar M.Y., Alamgir M., Hussain Z., Haq F.U., Syed Ghulam Musharraf S.G. (2015). HPLC determination of gamma amino butyric acid (GABA) and somebiogenic amines (BAs) in controlled, germinated, and fermentedbrown rice by pre-column derivatization. Journal of Cereal Science, 64, 56-62. 133
  3. [65] Janse van Rensburg H.C., Van den Ende W. (2020). Priming with γ- aAminobutyric acid against Botrytis cinerea Reshuffles Metabolism and Reactive Oxygen Species: Dissecting signalling and metabolism. Antioxidants (Basel), 9(12), 1174-1179. [66] Jt B. & Je D. (2020). Black tea flavonoids: A focus on thearubigins and their potential roles in diet & health. Nutr. Food Technol. Open Access 6. [67] Kim D.H., C. Dasagrandhi, S.K. Park, S.H. Eom (2018). Optimization of gamma-aminobutyric acid production using sea tangle extract by lactic acid bacterial fermentation. LWT - Food Sci. Technol. (Lebensmittel- Wissenschaft -Technol.), 90, 636-642. [68] Kim M.J., Kim K.S. (2012). Isolation and identification of γ- aminobutyric acid (GABA)-producing lactic acid bacteria from kimchi. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 55, 777-785. [69] Komatsuzaki N., Shima J, Kawamotoa S., Momosed H., Kimurab T. (2005). Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods. Food Microbiol. 22, 497-504. [70] Kumar S., & N.S. Punekar (1997). The metabolism of 4-aminobutyrate (GABA) in fungi, Mycol. Res., 101(4), 403-409. [71] Lee M. & Peng J. (2010) Effects of fermentation time and seasons on the γ-aminobutyric acid and glutamic acid contents of TTES - 12 GABA tea producing. The 5th International Symposium on Machinery and Mechatronics for Agriculture and Biosystems Engineering (ISMAB), 5- 7 April, Fukuoka, Japan. [72] Li H. & Y. Cao (2010). Lactic acid bacterial cell factories for gamma- aminobutyric acid. Amino Acids, 39, 1107-1116. [73] Li H., Qiu T., Gao D., Cao Y. (2010). Medium optimization for production of gamma-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis NCL912. Amino Acids, 38, 1439-1445. 135
  4. [83] Lu X., Xie C., Gu Z. (2008). Isolation of γ-aminobutyric acid producing bacteria and optimization of fermentative medium. Biochem. Eng. J. 41, 48-52. [84] Lv Hai-peng, Zhang Ying-jun, Lin Zhi, Liang Yue-rong (2013). Processing and chemical constituents of Pu-erh tea: A review. Food Research International, 53(2), 608-618. [85] Ma Z., Richard H., Tucker D.L., Conway T., Foster J.W. (2001). J. Bacteriol., 184, 7001-7012. [86] MarketWatch (2021). GABA Market Size, 2021 Regions Will Have the Highest Revenue, Which Will Emerge in Importance in the Market 2026. Available online: market-size-2021-regions-will-have-the-highest-revenue-which-will- emerge-in-importance-in-the-market-2026-2021-04-25 (accessed on 10 May 2021) [87] Martin D.L., Rimvall K. Regulation of γ-aminobutyric acid synthesis in the brain. J. Neurochem. 1993, 60, 395-407. [88] Martínez-Villaluenga, C., Kuo, Y.-H., Lambein, F., Frías, J., Vidal- Valverde, C. (2006). Kinetics of free protein amino acids, free non- protein amino acids and trigonelline in soybean (Glycine max L.) and lupin (Lupinus angustifolius L.) sprouts. Eur. Food Res. Technol., 224, 177-186. [89] Mau J.L., Chiou S.Y., Hsu C.A., Tsai H.L., Lin S.D. (2012). Antimutagenic and antimicrobial activities of γ - aminobutyric acid (Gaba) tea extract, IPCBEE, 39, 178-182. [90] McKay D.L., Blumberg J.B. The role of tea in human health (2002). An update. J. Am. Coll. Nutr. 21: 1-13. [91] Michaeli, S., Fait, A., Lagor, K., Nunes-Nesi, A., Grillich, N., Yellin, A., Bar, D., Khan, M., Fermie, A.R., Turani, F.J. & Fromm, H. (2011). A mitochondrial GABA permease connects the GABA shunt and the TCA 137
  5. [101] Perpetuini G., R. Tofalo, F. Tittarelli, N. Battistelli, G. Suzzi, R. Tofalo (2020). γ-aminobutyric acid produuction by Klyveromyces marxianus strains, J. Appl. Microbiol., 129(6), 1609-1619. [102] Phạm Quang Trung & Nguyen Công Ha (2016). Changes of Chemical properties and functional compounds during the germination of various brown rice in Mekong Delta Viet Nam". Agric. Food Tech, 6 (2), 1-6. [103] Pouliot-mathieu K., C. Gardner-fortier, S. Lemieux, D. St-gelais, C.P. Champagne, J. Vuillemard (2013). Effect of cheese containing gamma- aminobutyric acid-producing lactic acid bacteria on blood pressure in men. PharmaNutrition, 1(4), 141-148. [104] Rai A.K., A. Pandey, D. Sahoo (2019). Biotechnological potential of yeasts in functional food industry. Trends Food Sci. Technol., 83, 129-137. [105] Ramos-Ruiz R., Martinez F., Knauf-Beiter Gertrude (2019). The effect of GABA in plants. Cogent Food & Agriculture, 5, 1-12. [106] Rao L.J.M., Ramalakshmi K. (2011) High impact value-added products of tea. Recent Trends in Soft Beverages, 125-126. [107] Rashmi D., R. Zanan, S. John, K. Khandagale (2018). γ-aminobutyric acid (GABA): biosynthesis, role, commercial production, and applications, first ed., pp. 413-452, 57, chapter 13. [108] Renault H., El Amrani A., Berger A., Mouille G., Soubigou L., Taconnat L., Bouchereau A. (2013). γ-aminobutyric acid transaminase deficiency impairs central carbon metabolism and leads to cell wall defects during salt stres in Arabidopsis roots. Plant, Cell and Environment, 36, 1009-1018. [109] Roberts M.R. (2007). Does GABA Act as a Signal in Plants? Hints from Molecular Studies: Hints from Molecular Studies. Plant Signal. Behav., 2, 408-409. [110] Roohinejad S., K. Mallikarjunan M. Koubaa U. States (2018). Gamma- Aminobutyric Acid Production of GABA by Plants. Encyclopedia of Food Chemistry, pp. 528-534. 139
  6. [120] Tang A. S., Chung S. W., Kwong K., Xiao Y. Chen M. Y., Ho Y. Y., Ma S. W. (2011). Ethyl carbamate in fermented foods and beverages: Dietary exposure of the Hong Kong population in 2007-2008. Food Additives & Contaminants. Part B, Surveillance, 4(3), 195-204. [121] Tsushida T., Murai T., Omori M., Okamoto J. (1987). Production of new type tea containing a high level of γ-aminobutyric acid, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 61(7), 817-822. [122] US FDA (2021). US National Library of Medicine. Substance Registration System-Unique Ingredient Indentifier (UNII). Available online: (accessed on 24 March 2021). [123] US NIH (2021). Gamma-Aminobuytyric-Acid. United States National Institutes of Health. Available online: gov/compound/ gamma-Aminobutyric-acid (accessed on 5 May 2021). [124] Varga J., Frisvad J.C., Kocsubé S., Brankovics B., Tóth B., Szigeti G., Samson R.A. (2011). New and revisited species in Aspergillus section Nigri. Studies in Mycology, 69(1), 1-17. [125] Vinson JA. (2000). Black and green tea and heart disease: A review. BioFactors 13: 127-132. [126] Wan Y., Wang Q., Prud’homme G.J. (2015). GABAergic system in the endocrine pancreas: A new target for diabetes treatment. Diabetes Metab. Syndr. Obes., 8, 79-87. [127] Wang H.F., Tsai Y.S., Lin M.L., Ou, A.S.M. (2006) Comparison of bioactive components in GABA tea and green tea produced in Taiwan, Food Chem, 96(4), 648-653. [128] Wang J.J., Lee C.L., Pan T.M. (2003). Improvement of monacolin K, γ- aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of environmental conditions of Monascus purpureus NTU 601. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 669-676. [129] Watchararparpai W., Laohakunjit N., Kerdchoenchuen O., (2010). An Improved process for high quality and nutrition of brown rice production. Food Science and Technology International, 16(2), 147-158. 141
  7. [139] Zeng Z., Wu C., Huang Y., Wu J. (2012). Study on flavour volatiles of γ- aminobutyric acid (GABA) green tea. African Journal of Biotechnology, 11(51), 1333-11341. [140] Zhang Q., S. Qing, T. Xiao, Z. Shuming, Z. Lin, T. Jie, X. Wenliang (2019). Characterization of γ -aminobutyric acid (GABA) -producing Saccharomyces cerevisiae and coculture with Lactobacillus plantarum for mulberry beverage brewing. J. Biosci. Bioeng., 129(4), 447-453. [141] Zhong Y., S. Wu, F. Chen, M. He, J. Lin (2019). Isolation of high γ - aminobutyric acid - producing lactic acid bacteria and fermentation in mulberry leaf powders. Experimental and Therapeutic Medicine, 18, 147-153. [142] Zhu N., Wang T., Ge L., Li Y., Zhang X., Bao H. (2017). Gamma-amino butyric acid (GABA) synthesis enabled by copper-catalyzed carboamination of alkenes. Org. Lett., 19, 4718-4721. [143] Oketch-Rabah H.A. et al. (2021). United States pharmacopedia (USP) safety review of gamma-aminobutyric acid (GABA). Nutrients, 13, 2742. [144] Sahab N.R.M., Subroto E., Balia R.L., Utama G.L. (2020). γ- aminobutyric acid found in fermented foods and beveragesL curent trends. Heliyon,6, e05526. [145] Choi S-H, Kim I-D, Dhungana S.K., Shin D-H. (2022). Comparison of quality and bioactive components of Korean green, white, and black teas and their associated GABA teas. Korean J. Food Sci. Technol., 54(2), 228-234. [146] Kanklai J., Somwong T.C., Rungsirivanich P., Thongwai N. (2021). Screening of GABA-producing lactic acid bacteria from Thai fermented foods and probiotic potential of Levilactobacillus brevis F064A for GABA-fermented mulberry juice production. Microorganisms, 9(1), 33. [147] Tanamool V., Hongsachart P., Soemphol W. (2020). Screening and characterisation of gamma-aminobutyric acid (GABA) producing lactic acid bacteria isolated from Thai fermented fish (Plaa-som) in Nong Khai 143
  8. PHỤ LỤC 145
  9. - Hoà tan DNA trong 50-100 l nước hoặc TE. - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100 V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 ph, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 ph vớt ra. Quan sát trên máy soi gel. 2.2. Phản ứng khuếch đại ADN Thành phần phản ứng như sau: Thành phần Thể tích (l) 10X buffer 10 dNTP 2.0 Mm 10 Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngược (10 pmol/l) 2 Taq polymerase (5u/l) 2 ADN khuôn (50-100 g/l) 1-2 H2O đủ 100 Chu trình nhiệt: 95oC - 3 ph 95oC - 30 s 30 chu kì 56oC - 15 s 72oC - 1 ph 72oC - 5 ph 40oC - 2.3. Mồi: Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l 147
  10. 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen: 96oC - 1 ph 96oC - 10 s 50oC - 5 s 25 chu kỳ 60oC - 4 ph 2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự - Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch - Thêm 5 l EDTA 125 mM và 60 l ethanol 100%. Để khoảng 15 ph ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph - Bỏ dịch, thêm 60 l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 ph - Làm khô. - Thêm 10 l HiDi Formamide, để ở 96oC trong 2 ph - Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh - Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự. - Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant 2.7. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại Trình tự của ADNr 16S được phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và cộng sự (1997). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987). 149
  11. Bảng PL.2. Kết quả ly tâm liên tục STT Chủng vi khuẩn Lượng tế bào sót trong Độ nhiễm dịch sau ly tâm (CFU/ml) (CFU/ml) 1 VTCC-B-439 5x108 5x103 2 VTCC-B-411 6x108 6x103 Sử dụng thiết bị ly tâm alphalaval ở tốc độ 5000 v/ph và tốc độ dòng chảy 200 lit/h, chúng tôi đã thu được sinh khối và đánh giá lượng tế bào sót và tạp nhiễm trong dịch sau ly tâm. Kết quả được trình bày trong bảng cho thấy hầu hết sinh khối vi khuẩn (90%) được tách ra sau ly tâm, với mật độ tế bào ban đầu 109CFU/ml và dịch sau ly tâm là 108CFU/ml. Tuy nhiên chúng tôi đã phát hiện nhiễm tạp trong quá trình ly tâm (trong cả sinh khối và dịch sau ly tâm) với lượng nhỏ (103 CFU/ml). Sự có mặt của vi sinh vật nhiễm (Bacillus) với tỷ lệ thấp nhưng vẫn cao hơn tiêu chuẩn Việt Nam (≤1x103) cho thấy phương pháp ly tâm liên tục không đảm bảo về mặt an toàn sản phẩm. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang và tỷ lệ phối trộn của chất mang đến khả năng sống của vi khuẩn Các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu: Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 và Lactobacillus casei VTCC-B-411 không có bào tử nên việc làm khô trong bất kỳ hình thức nào như phun sấy hay đông khô đều dẫn đến sự chết và bất hoạt các tế bào dinh dưỡng ở tỷ lệ khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn kỹ thuật đông khô là quá trình làm khô trong lạnh đối với sinh khối vi khuẩn thu được sau lên men. Dịch sinh khối thu được sau bước lọc tiếp tuyến ở trên ở dạng past, việc bổ sung chất mang đạt độ khô 55-60% có tác dụng bảo vệ tế bào, giảm tỷ lệ chết trong quá trình đông khô. Trong nghiên cứu này với tỷ lệ chất mang và dịch vi khuẩn 1:1 theo lượng chất khô là 60%. Kết quả quá trình đông khô các mẫu vi khuẩn được trình bày trong bảng 3.10 như sau: Kết quả trong Bảng PL-3 cho thấy thời gian đông khô không phụ thuộc vào chất mang mà phụ thuộc vào chủng vi khuẩn dao động từ 12-14 h. Việc so sánh các công thức chất mang được tiến hành đồng thời cho mỗi chủng với 6 công thức từ 1- 6 cho thấy công thức 2 là công thức tốt hơn cả cho cả 2 chủng vi khuẩn nghiên cứu. 151
  12. Bảng PL-4. Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản trong điều kiện khác nhau ĐK bảo Số lượng vi khuẩn (CFU/g) sau thời gian bảo quản (tháng) Chủng quản (oC) 0 1 2 3 4 5 6 -20 7x1010 7x1010 7x1010 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 VTCC- 4 7x1010 6x1010 5x1010 3x1010 2x1010 9x109 6x1010 B-439 25-30 7x1010 4x1010 7x109 2x109 8x108 3x108 8x107 -20 6x1010 6x1010 6x1010 5x1010 5x1010 5x1010 5x1010 VTCC- 4 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 3x1010 1x1010 8x109 B-411 25-30 6x1010 5x1010 2x1010 8x109 3x1010 7x108 1x108 Kết quả bảng PL-4 cho thấy điều kiện bảo quản ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót của chủng vi khuẩn trong chế phẩm. Trong tất cả các chủng, điều kiện bảo quản tại -20oC là tốt nhất sau đó là 4oC. Trong điều kiện này, số lượng tế bào sống giảm (so với ban đầu) nhưng không quá 10-30 lần. Lượng vi sinh vật sống giảm mạnh khi bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thường, số lượng vi khuẩn sống sót giảm 50- 100 lần có trường hợp (Lactobacillus plantarum VTCCB439) giảm 1000 lần. Vì vậy, chủng Lactobacillus casei VTCC-B-411 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Tóm lại: Thu hồi sinh khối sử dụng phương pháp ly tâm theo mẻ tại tốc độ 5000 v/ph trong 10 ph có thể thu được hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn trong dịch sau lên men, thích hợp cho các nghiên cứu nhỏ ban đầu trong phòng thí nghiệm. Sử dụng kỹ thuật lọc tiếp tuyến cho hiệu suất thu hồi sinh khối cao từ thể tích lớn dịch sau lên men và hạn chế được vi sinh vật tạp nhiễm so với phương pháp ly tâm liên tục. Sử dụng chất mang là lactose và sữa gầy theo tỷ lệ 1:1 mang lại hiệu quả cao nhất khi đông khô sinh khối các chủng vi khuẩn nghiên cứu, mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g. Điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn tại-20oC cho kết quả tốt nhất, số lượng tế bào sống đạt 1010CFU/g sau 6 tháng bảo quản./. 153
  13. lít chứa 3 lít môi trường MT2(pH6), nuôi khuấy 30 vòng/ph ở 35oC. Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh sạch bằng cách cấy ria vào môi trường thạch MT2. Sau 20-24 h, lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào trên máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm. Mật 10 độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥10 cfu/ml). Đồng thời quan sát khuẩn lạc trong đĩa thạch MT2 đã cấy. Hình PL-1. Sơ đồ quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng trong lên men chè giàu GABA 155
  14. 2. Sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng trong lên men chè giàu GABA Từ quy trình sản xuất sinh khối, chúng tôi tiến hành lên men sản xuất 10 mẻ thu sinh khối vi khuẩn. Sau mỗi mẻ sản xuất, chúng tôi kiểm tra số lượng tế bào của chủng vi khuẩn lactic và độ sạch của mẻ lên men. Kết quả được thể hiện ở Bảng PL- 5. Kết quả bảng PL-5 cho thấy quy trình sản xuất sinh khối chủng vi khuẩn lactic có tính khả thi và có độ ổn định cao giữa các mẻ. Dựa vào khối lượng sinh khối thu được giữa các mẻ cũng như độ sạch của các mẻ thu hồi cho thấy quy trình mà chúng tôi xây dựng là phù hợp với các điều kiện khí hậu ở Việt Nam. Bảng PL-5. Kết quả lên men vi khuẩn lactic Khối lượng sinh khối Mật độ CFU/ml Mẻ sản xuất Độ sạch (%) (g) trước thu sinh khối Mẻ 1 148.5 98.9 4.1010 Mẻ 2 149.4 99.2 2,1.1010 Mẻ 3 152.7 98.7 5.1010 Mẻ 4 153.3 98.6 7.1010 Mẻ 5 151.8 98.2 4.1010 Mẻ 6 144.3 98.7 1,9.1010 Mẻ 7 151.2 98.8 4.1010 Mẻ 8 148.2 99.2 5.1010 Mẻ 9 152.4 98.6 6.1010 Mẻ 10 154.2 98.6 6.1010 157
  15. Hình PL4.3. Phun trộn chè với dịch thể chủng giống vi khuẩn để lên men Hình PL4.4. Chè sau lên men yếm khí kết hợp lên men vi khuẩn lactic 159